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登革熱疫苗的近期發展-黃群翔

一. 前言:
  登革熱(Dengue fever, DF)是經由登革病毒(Dengue virus, DENV)所引起的一種急性傳染病。最早於1779 年埃及開羅、印尼雅加達和美國費城發現,當時根據病毒所引起的臨床特徵命名,患者普遍會出現高熱,肌肉、骨髓及關節疼痛等症狀, 所以臺灣俗稱斷骨熱或天狗熱;最後於1869 年由英國倫敦皇家內科學會正式命名為登革熱;1943 年由日本科學家首先分離出登革病毒 。
  登革病毒屬於黃病毒科 (Flaviviridae),黃病毒屬(flavivirus),該屬病毒還包含了黃熱病病毒(YFV),西尼羅河病毒(WNV),日本腦炎病毒(JEV)和蜱傳腦炎病毒。病毒顆粒形狀為球形,直徑約50nm。遺傳物質為單股正鏈RNA((+)ssRNA),長約11kb,可轉譯出3 個結構蛋白(capsid protein C, membrane protein M, envelope protein E)和7 個非結構蛋白(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5)。根據抗原性的不同,登革病毒又可以分為四種血清型,分別是1、2、3、4 等四型 ;2013 年美國德克薩斯大學醫學分校的Nikos Vasilakis 博士依據所採集之病患檢體提出有第5 型的存在。一般來說如果患者感染到其中一型的登革病毒,就會對其終生免疫,但是對其他型別的登革病毒僅有2-9 個月的短暫保護作用,過了這段期間之後仍然可能會感染其他的型別 。
  登革病毒主要是靠埃及斑蚊(Aedes aegypti) 或白線斑蚊(Aedes albopictus)傳播,主要流行於熱帶及亞熱帶地區,特別是在東南亞地區容易出現地方性的流行,但自交通運輸工具的進步,加上人口越來越稠密,使得病毒的傳播更為快速,直到1990 年登革熱迅速擴散成為全球公衛議題,由1991 年及2013 年各國回報世界衛生組織 (WHO)資料,登革熱在北半球1 月均溫10℃及南半球7 月 均溫10℃範圍內的區域急速擴增,而染病人數在這20 年內也激增10 倍 ,這讓WHO 將之列為重點傳染病之一。
  估計全球大約有25億人生活在感染登革熱危險的熱帶及亞熱帶地區,每年超過5千萬人感染登革熱,其中有50萬人發展成嚴重型的登革熱(出血性登革熱/登革熱休克症候群),2萬人死亡,平均死亡率大約是1-5%。 以2010年為例,全球登革熱疫情累積發生率與病例數統計,位居前五名國家皆在中南美洲,台灣累積病例數為1865人。

登革熱的分類及症狀
  登革熱是一種急性和自限性登革疾病,臨床症狀從無症狀到典型登革熱症狀,甚至引發嚴重的出血性登革熱或登革熱休克症候群等。原發性登革熱較常發生在兒童,而臨床症狀較常出現在成人。當病毒在網狀內皮細胞組織和皮下繁殖時,稱之為病毒血症期,病毒在人體內的潛伏期大約3-14天,平均約4-7天。一般將臨床症狀分為:

一、 典型的登革熱症狀:
  發燒(持續2~7天,體溫約39-40度)、頭痛、肌肉痛、骨骼關節痛、臉部潮紅、皮疹(約有一半的患者出現紅色斑點或融合性紅色丘疹)、淋巴結腫大、眼睛結膜充血、常伴隨著白血球減少、血小板數量異常減少、後眼窩痛、畏光等等,更多嚴重的個案有無法改善的骨頭或關節疼痛(又稱斷骨熱),多發生在成年人。

二、出血性登革熱症狀(DHF),診斷為出血性登革熱須符合四個條件:
(一)發燒

(二)出血傾向: 止血帶測試陽性(止血帶測試陽性是指微血管受損,利用血壓帶在患者前臂加壓,壓力介於收縮壓和舒張壓的中間值,五分鐘後再觀察血壓帶擠壓處或受壓之手臂前端每平方英吋(6.25cm)範圍內的出血點數目,若有二十個或超過二十個以上的出血點即為陽性反應);點狀出血、瘀斑、紫斑;黏膜、腸胃道或注射點滴處或其他地方出血;血便、吐血,符合以上條件之一。

(三)血小板低下(少於10萬以下)

(四)血漿滲漏:血比容增加20%以上;輸液治療後血比容下降20%;血清白蛋白低下或臨床上出現肋膜積水或腹水。

世界衛生組織(WHO)將出血性登革熱分為四等級:
.第一級 (gradeⅠ):符合上述四個診斷條件,但無自發性出血表現。
.第二級(gradeⅡ):有自發性出血的情形。
.第三級 (gradeⅢ):合併皮膚濕冷、四肢冰冷、坐立不安、脈搏微弱,幾乎測不到(脈搏壓≦20mmHg)。
.第四級 (gradeⅣ):測量不到脈搏,需施行心肺復甦術。
.第三、四級又稱為登革熱休克症候群。

三、登革熱休克症候群(DSS):有出血性登革熱病徵、低血壓(收縮壓≦100mmHg)、脈搏微弱(脈搏壓≦20mmHg)、皮膚濕冷、四肢冰涼、昏厥等。

登革熱的病毒致病機轉

  依病毒表面抗原的不同,可分為四種不同血清型的登革病毒,分別為登革第一、二、三及四型(DENV 1-4),四種皆具傳染力,人類若感染其中一型的登革病毒,則只對該型病毒具有終身免疫力,但對於其他血清型的病毒則不具免疫力,所以患者有可能重複感染登革熱。
  人類皮膚的蘭格罕氏細胞/ 樹突細胞(Langerhans cells / Dendritic cells)是登革病毒感染的主要目標。當病媒蚊叮咬人類後,登革病毒經由樹突細胞上非特異性的ICAM-3結合了DC-SIGN接受器。感染的樹突細胞會遷移至局部或附近區域的淋巴結並呈現病毒抗原給T細胞,因而啟動細胞及體液免疫反應。
  引發登革出血熱(Dengue Hemorrhagic Fever;DHF)及登革休克症候群(Dengue Shock Syndrome;DSS)真正的致病機轉還無法完整被瞭解,其致病機轉與下列現象及因素有關:
一、 抗體依賴性增強反應(Antibody dependent enhancement, ADE)
二、血漿滲漏(Plasma leakage)
三、補體活化(Complement activation)

登革熱疫苗發展的挑戰

  登革熱疫苗的研究已超過60年了,早期疫苗的發展可追朔到1950年代,Sabin和Schlesinger等人利用鼠腦培育出減毒性的夏威夷株登革熱病毒並且接種在受試者身上,他們發現受試者在接種該疫苗後可以免於登革熱病毒感染。自1970年代起,美國科學家開始利用細胞株來發展疫苗,從此開啟了登革熱疫苗發展的歷程。

疫苗的發展有幾種不同類型,包括:
一、活性減毒疫苗(live attenuated vaccine):
  利用細胞株的培養方法,將原本高度致病性的病毒經過一系列的世代培養後,使病毒的致病性下降,但保留其引發保護性免疫的作用,此類疫苗已有進入臨床試驗階段,但仍有幾個重大問題尚待解決:1、疫苗病毒株可能轉變回致病型病毒株;2、免疫受抑制的患者可能引發疾病產生;3、懷孕前期接種,可能引發畸胎;4、接種四種效價血清疫苗者,所產生的抗體彼此間可能干擾,而導致保護力下降。
  目前新的趨勢為使用點突變技術,針對病毒基因修改導致病毒毒性減弱,第一個被證實有效減弱登革病毒的疫苗為DEN4Δ30,主要是刪除DENV-4 基因組中3’未轉錄區域的30個核苷酸(Δ30)。
  美國衛生研究院 (National Institutes of Health,NIH) 與約翰霍普金斯大學 (Johns Hopkins University)合作研究出之四價活性減毒疫苗 (TetraVax-DV) ,即為DENV1~4的四株減毒突變病毒株混合製成,便是屬於此型。然而當DENV-1及DENV-4使用此方式策略奏效時,DENV-2及DENV-3卻無法達到相同的效果。因此另一種替代DENV-2與DENV-3的嵌合疫苗策略因應而生,主要以DEN4Δ30為骨架建構DENV-2及DENV-3(稱為DEN2/4Δ30及DEN3/4Δ30),這些單價的DENV活性減毒疫苗株分別為DEN1Δ30、DEN2/4Δ30、DEN3/4Δ30、DEN3Δ30/31和DEN4Δ30。四價疫苗在臨床試驗一期中也已證實不會引發受試者產生病毒血症(viremic),在1,000 PFU的劑量下可對DENV-1、2、3產生均衡的免疫反應,現正於巴西進行第二期臨床試驗。

二、活性減毒性複合疫苗(live attenuated chimericvaccine):
  利用其他類型黃病毒(如黃熱病病毒、日本腦炎病毒)與登革熱病毒做融合以產生新的病毒株,其毒性會降低,但對免疫反應不會有太大影響,此類型疫苗已進入臨床試驗。
  目前最先進的產品為法國Sanofi Pasteur公司製造的ChimeriVax四價登革熱疫苗(CYD-TDV),主要是使用已經取得藥證的黃熱病17D (YFV-17D)疫苗為骨幹,使YFV-17D分別帶有四種DENV的prM及E基因。臨床前試驗已證實基因型和表現型穩定,不會干擾DENV抗原呈現,且神經毒性比YFV 17D疫苗更少。另外在猴子實驗中成功產生免疫原性,並能夠引起TH1細胞發生細胞免疫反應。四價CVD疫苗的一期臨床試驗顯示高安全及相對較低的病毒血症,而在二期臨床試驗中,經接種疫苗後受試者血清中的抗體效價皆有上升。整體而言對DENV-1、3和4可提供61.2%、81.9%和90%的較高保護效果,然而對DENV-2只有3.5%;其中有134位受試孩童在試驗期間感染登革病毒,以此來分析得到疫苗保護效果有30%。2013年已進入第三期臨床試驗,於泰國、馬來西亞及中南美洲等登革熱流行 疫區共招募31,000名兒童與成人試驗者,其中在馬來西亞250名2-11歲的 受試孩童的結果顯示,注射CYD-TDV後可以對四種型別的DENV產生中和 效價,最低的為4.8倍 (DENV-1) 、最高為8.1倍 (DENV-3) 。
  美國疾病管制與預防中心也將其所開發之嵌合活性減毒疫苗 (DENVax) 授權Inviragen公司,此疫苗株以減毒的DENV-2型作為骨幹,分別把其他3種DENV之套膜(prM)及封套(E)基因置換於該病毒中,獲得DENVax疫苗株,然後利用狗的腎臟初代培養細胞進行繼代。美國、哥倫比亞、新加坡及泰國等地已完成臨床一期與二期。此外中國北京科學家開發之ChinDENV嵌合疫苗,以日本腦炎病毒( Japanese Encephalitis Virus, JEV )活毒疫苗為骨架嵌合DEVN2封套(E)基因發展而來,於小鼠及非人靈長類動物之臨床前試驗上均獲得抵抗DENV的效果,另外也能抵抗JEV之侵襲。

三、非活化病毒疫苗(inactivated virus vaccine):
  利用福馬林將培育出來的登革熱病毒去活化,好處是疫苗本身不會轉變致病的病毒株,對四種血清型病毒產生同等效價的抗體反應,但抗體的效價會因物種的不同而有所差異,這也是該疫苗所面臨的問題之一。
  目前葛蘭素史克(GlaxoSmith-Kline, GSK)開發的不活化疫苗(TDEN-PIV)最受到重視,其疫苗株以VERO細胞作為宿主進行增殖,不活化後加入GSK開發之AS03B或AS01E佐劑,在美國及波多黎各兩地已完成臨床一期試驗,此刻正進行臨床二期。

四、病毒載體、DNA及次級單位疫苗(Live recombinant, DNA and subunit vaccines):
1.病毒載體疫苗(viral vector):利用其他種類病毒當作運輸工具,將登革熱病毒的DNA運送至細胞內,在胞內製造出相關的抗原並表現在細胞外,人體的免疫細胞會辨識該抗原,並產生相對應的抗體。腺病毒是最常用的病毒載體,但問題是如果病人在接種疫苗之前就已經感染相關的病毒時,體內就會產生對抗該病毒的抗體,相對地會對疫苗的效價有所影響。

2. DNA疫苗:將登革熱病毒基因崁入質體(plasmid)中,在接種後,質體會被細胞攝入並在胞內合成病毒抗原,像自然感染一樣,人體產生該抗原的抗體,達到免疫效果,但此類疫苗最大的障礙在於它施打的時程拖得太長。

3.病毒次單元疫苗: E蛋白(E protein)是登革熱病毒引發中和性抗體的主要抗原,利用不同生物,如大腸桿菌、酵母菌或果蠅,製造大量E蛋白,不同種類的E蛋白疫苗已在各個實驗室測試過,但尚無令人滿意的效果。

  然而,可惜的是與活性減毒疫苗相比,此類疫苗幾何平均抗體效價(GMT, geometric mean titer) 偏低。

探討與結論

  雖然目前未有藥證的登革熱疫苗可用,但經過不斷累積對登革熱認知與了解,則可以提供更多的見解以及改善疫苗設計構思。
  台灣位居亞熱帶地區,雖然疫情不像南美洲或東南亞那樣嚴重,但我們仍應小心防範,因為台灣的天氣是屬於潮濕、溫熱型態,有利於蚊蠅的滋生,再加上全球氣候的暖化及國際交流的日益頻繁,登革熱不再只是侷限於熱帶或是亞熱帶國家的急性發熱性病毒感染,所以防治工作不可懈怠。
  而登革熱的防治是多面向的,除了媒介物的控制與環境的改善之外,疫苗的發展也是其中不可或缺的一環。在過去,發展登革熱疫苗總是被西方國家所忽略,但隨著疫情的延燒,已引起世界衛生組織的重視。儘管登革熱疫苗的發展已經走了數十個年頭,但最大的障礙在於免疫反應所介入的相關因子與疾病病理機轉及嚴重性之間的關係仍無法完全瞭解。所幸近幾年來在各地大量的登革熱疫苗研究及臨床試驗已提供許多新的發現及線索,此快速進展提供了人類防治傳染性疾病的新希望。

參考資料:
1、衛生福利部疾病管制署、http://www.cdc.gov.tw/error.html?aspxerrorpath=/
2、 Dadu Elementary School in Dadu District, Taichung
Department of Nursing, Hungkuang University Received 26 July 2011 ; accepted 1 September
3、感染控制雜誌
 
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